Das Prinzip der Dünnschicht-Chromatographie besteht darin, ein geeignetes Sorptionsmittel in einer dünnen Schicht auf einer Glasplatte auszubreiten, diese Schicht zu trocknen, evtl. zu aktivieren und anschließend auf einem "Startpunkt" einen Tropfen der zu analysierenden Ausgangslösung aufzubringen. Nach dem Abdampfen des hierbei benutzten Lösungsmittels wird die Platte in ein gut verschlossenes Gefäß mit Solvens gestellt, das infolge Kapillarwirkung nach oben wandernd die Schicht durchläuft. Hierbei wird das Trenngemisch in eine seiner Komponentenzahl entsprechende Zahl von Flecken aufgetrennt, die dann alle in einer Linie senkrecht vom Startpunkt nach oben bis zur Steighöhe des Solvens (Lösungsmittelfront) liegen müssen. Die Zeichnung zeigt das Schema einer derartigen Auftrennung auf einer dünnschicht-chromatographischen Platte.

Nach der Auftrennung können die einzelnen Flecken entweder an ihrer Eigenfarbe im Tageslicht erkannt werden, bzw. sie müssen durch Reagenzien oder andere Hilfsmittel wie Fluoreszenzzusätze, UV-Licht usw. sichtbar gemacht werden.